Como usar ultra-som para a ruptura celular e extração de DNA/RNA?

Como usar ultrassom para ruptura celular e extração de DNA/RNA?

O ultrassom é uma tecnologia eficiente e comumente usada na ruptura celular e extração de ácidos nucleicos (DNA/RNA). Seu princípio central é usar o efeito de cavitação e vibração mecânica para destruir a estrutura celular e liberar substâncias internas. A seguir, uma explicação do mecanismo específico, processo de aplicação e precauções importantes:

I. Princípio e processo do ultrassom para ruptura celular
A essência da ruptura celular é destruir a membrana celular (células animais) ou parede celular + membrana celular (plantas, bactérias, fungos, etc.) para liberar substâncias intracelulares (como ácidos nucleicos, proteínas, organelas, etc.). O ultrassom realiza esse processo através dos seguintes mecanismos:
1. Princípio central: efeito de cavitação
O ultrassom é uma onda mecânica de alta frequência com uma frequência superior a 20kHz. Quando a sonda ultrassônica (amplificador do desintegrador ultrassônico) é inserida em uma amostra líquida contendo células, é gerada uma vibração de alta frequência (geralmente 15-50kHz), que desencadeia a cavitação no meio líquido:

A vibração de alta frequência faz com que um grande número de pequenas bolhas (bolhas de cavitação) se forme no líquido. Essas bolhas se expandem e comprimem rapidamente sob mudanças de pressão e, finalmente, explodem violentamente (colapso).
Quando as bolhas explodem, uma enorme energia instantânea (alta temperatura local, alta pressão e fortes ondas de choque) é liberada, e a força de impacto gerada rasgará diretamente a estrutura da membrana da célula (membrana celular, parede celular) para obter a fragmentação celular.
2. Efeito auxiliar: vibração mecânica e força de cisalhamento
A vibração mecânica de alta frequência do ultrassom também gerará diretamente força de cisalhamento e força de atrito nas células, auxiliando ainda mais na destruição da estrutura celular, especialmente para células com paredes celulares espessas (como fungos e células vegetais).
3. Processo de fragmentação (tomando a operação experimental como exemplo)
Coloque a suspensão celular a ser tratada (como fluido de cultura bacteriana, homogeneizado de tecido, etc.) em um tubo de centrífuga ou béquer, insira a sonda ultrassônica (chifre), e a sonda precisa ser imersa no líquido, mas não em contato com a parede do recipiente.

Ligue o instrumento ultrassônico e defina os parâmetros (potência, tempo, etc.): a vibração de alta frequência gera bolhas de cavitação no líquido, e a força de impacto gerada pela explosão das bolhas destrói diretamente a estrutura celular e libera substâncias intracelulares (incluindo ácidos nucleicos, proteínas, metabólitos, etc.).
2. Aplicação específica do ultrassom na extração de DNA/RNA
As etapas principais da extração de DNA/RNA incluem: ruptura celular para liberar ácidos nucleicos → remoção de impurezas (proteínas, lipídios, polissacarídeos, etc.) → purificação de ácidos nucleicos. O papel do ultrassom está concentrado principalmente na primeira etapa - ruptura celular eficiente e liberação de ácidos nucleicos. Os cenários de aplicação e vantagens específicos são os seguintes:
1. Tipos de amostras adequados
O ultrassom é adequado para a extração de ácidos nucleicos de uma variedade de amostras, incluindo:

Tecido animal (como fígado, músculo): precisa ser cortado em pedaços pequenos primeiro, o ultrassom pode romper rapidamente as células e liberar ácidos nucleicos;
Bactérias/fungos: as paredes celulares são relativamente duras, os métodos tradicionais (como o tratamento com lisozima) são ineficientes, e o ultrassom pode destruir as paredes celulares através do forte efeito de cavitação;
Células cultivadas (células aderentes ou suspensas): suspensão direta e, em seguida, ultrassom, nenhum pré-tratamento complexo é necessário;
Tecido vegetal: contém celulose e pectina, o ultrassom pode auxiliar na quebra das paredes celulares e na liberação do conteúdo celular.
2. Parâmetros-chave na operação (afetando a qualidade do ácido nucleico)
O tratamento ultrassônico requer controle estrito dos parâmetros para evitar a degradação do ácido nucleico ou fragmentação excessiva (afetando experimentos subsequentes, como PCR, sequenciamento, etc.):

Potência: geralmente 50-300W (ajustado de acordo com o tipo de amostra, como bactérias que exigem maior potência). Potência muito alta fará com que o cisalhamento do ácido nucleico seja muito curto, e potência muito baixa resultará em fragmentação insuficiente.
Tempo de trabalho/intervalo: Use tratamento de "pulso" (como trabalhar 30 segundos + intervalo 30 segundos) para evitar a geração contínua de calor ultrassônico, levando à desnaturação do ácido nucleico (DNA/RNA é facilmente degradado em alta temperatura).
Tempo total de tratamento: Depende da amostra (como 1-3 minutos para células animais e 3-5 minutos para bactérias). O tratamento excessivo agravará a fragmentação do ácido nucleico.
Controle de temperatura: Banho de gelo durante todo o processo (as amostras são colocadas no gelo), porque o processo ultrassônico gerará calor (efeito de cavitação acompanhado de alta temperatura local), a baixa temperatura pode inibir a atividade da nuclease e proteger a estabilidade do ácido nucleico.

3. Vantagens e precauções
Vantagens
Alta eficiência: Mais rápido do que os métodos tradicionais (como moagem, congelamento e descongelamento repetidos, hidrólise enzimática) (geralmente concluído em poucos minutos) e ruptura mais completa;
Universalidade: Aplicável a uma variedade de tipos de amostras (animais, plantas, microrganismos, etc.);
Fácil de operar: Nenhum reagente complexo é necessário, apenas instrumentos ultrassônicos e equipamentos básicos de centrifugação são necessários.
Precauções
Evite bolhas: Se houver um grande número de bolhas na amostra, a eficiência do efeito de cavitação será reduzida e a sonda poderá superaquecer. Certifique-se de que a sonda esteja completamente imersa no líquido (o nível do líquido é de cerca de 1-2 cm);
Inibição da nuclease: Após a ruptura, a solução de lise (incluindo EDTA, detergente, etc.) deve ser adicionada a tempo de inibir as nucleases intracelulares (como a RNase que degrada facilmente o RNA);
Volume da amostra: O volume de processamento único não deve ser muito grande (geralmente ≤5mL), caso contrário, a distribuição de energia ultrassônica será desigual e o efeito de ruptura variará muito.

Resumo
O ultrassom rompe eficientemente as células através do efeito de cavitação e vibração mecânica, fornecendo uma "etapa de liberação" chave para a extração de DNA/RNA. O essencial é otimizar a potência, o tempo e a temperatura para romper totalmente as células, maximizando a proteção da integridade do ácido nucleico. Essa tecnologia é amplamente utilizada na fase de pré-processamento de experimentos de biologia molecular (como clonagem de genes, qPCR, análise de transcriptoma, etc.) e é uma ferramenta importante para a extração de ácidos nucleicos.